学术成果丨嘉士腾助力胰腺癌类器官建模，验证PDNM可作为siKRAS递送和基因治疗的潜在载体

近日，浙江省人民医院与嘉士腾合作，通过培养患者来源的胰腺癌类器官进一步证实三嵌段阳离子聚合物PDMAEMA-co-PNIPAM-co-PMPC（PDNM）可作为siKRAS递送和基因治疗的潜在载体。目前，该研究已发表在国际权威期刊Chemical Engineering Journal（IF: 15.1）上。

研究发现，采用PDNM/siKRAS转染的纳米颗粒具有良好的抗肿瘤作用，在缩小肿瘤体积、降低Ki67表达的同时不会对其他器官造成明显损伤。值得注意的是，在患者来源的类器官（PDO）中转染的纳米颗粒也表现出类似的抑制作用。

01/研究背景

胰腺导管腺癌（PDAC）增殖快，侵袭性强。由于复杂的血管系统及与周围器官临近，手术干预在实现胰腺病变完全切除方面受到一定限制。研究发现，KRAS突变可维持KRAS-GTP构象并激活癌症下游信号传导。目前，抑制KRAS表达已被广泛用于癌症的基因治疗。此外，siRNA也是一种很有前景的基因治疗方法，通常被用于干扰靶基因尤其是KRAS，以抑制PDAC。然而，因siRNA不稳定，易于酶降解，且细胞摄取有限，在临床应用受到挑战。因此，急需精准、有效地将siRNA递送到细胞载体，以确保siRNA的进一步临床转化。肿瘤类器官是源自肿瘤组织中肿瘤特异性干细胞通过三维组织培养形成的细胞簇，可模拟体内肿瘤特征及肿瘤细胞异质性。近年来，越来越多的研究使用PDO模拟肿瘤异质性。该研究通过光引发自由基聚合开发了一种三嵌段共聚物PDNM作为基因载体，并通过体外、体内实验及PDO模型验证PDNM/siKRAS纳米颗粒的治疗效果。

02/主要结果

2.1 PDNM/siKRAS纳米颗粒的合成与表征

该研究设计了一种新型低毒性三嵌段共聚物PDNM，通过光引发自由基聚合合成（图1A），且通过1H-NMR光谱证实合成物的结构和表征（图1B）。PDNM成功合成后，与siKRAS在37°C下孵育30 min以形成纳米颗粒。进行凝胶电泳以评估PDNM/siKRAS的组装并确定最佳缩合（图2A）。与PDNM的ζ电位值相比，PDNM/siKRAS纳米颗粒值更低。此外，使用透射电子显微镜（TEM）检查质量比为5.0时PDNM/siKRAS纳米颗粒形态（图2B），观察到直径约为200 nm的球形纳米颗粒。

使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估PDNM/siKRAS纳米颗粒的转染效率，发现FAM标记的siKRAS中未观察到绿色荧光，而PDNM和PEI诱导的siKRAS在细胞核附近表现出明显的绿色荧光（图2C）。此外，流式细胞术证实了不同质量比下PDNM的转染效率（图2D）。摄取效率和荧光强度定量分析显示，PDNM（质量比>5.0）具有与PEI相似的siKRAS递送效率，而PDNM诱导的siKRAS（质量比>5.0）表现出更高的平均荧光强度（图2E）。

图1. （A）由DMAEMA、NIPAM和MPC组成的PDNM；（B）PDNM的1H-NMR光谱。

图2. （A）PDNM/siKRAS凝胶电泳，（B）PDNM/siKRAS颗粒在TEM下的形态，（C） FAM标记的FAM-siKRAS和PEI/FAM-siKRAS的siKRAS递送效率，以及PDNM/FAM-siKRAS的质量比，（D）FAM标记的不同纳米颗粒siKRAS递送效率的流式细胞术分析。（E）吸收效率百分比和平均荧光强度的定量分析。

2.2 PDNM/siKRAS递送系统的肿瘤杀伤作用

与PDNM和PEI处理的AsPC-1细胞相比，PDNM/siKRAS和PEI/siKRAS纳米颗粒红色荧光更显著（图3A）。采用Annexin V-FITC/PI试剂盒对PDNM/siKRAS处理的AsPC-1细胞染色，并进行流式细胞术分析（图3B）。结果显示，采用游离siKRAS处理对细胞凋亡未见显著影响。与对照组（0.8%）相比，PDNM组（10.8%）和PEI组（27.4%）凋亡率增加。此外，与单独PDNM相比，PDNM/siKRAS处理可显著增加早晚期细胞凋亡，表明PDNM/siKRAS转染引发了肿瘤杀伤作用；与PEI处理的晚期细胞凋亡相比，PEI/siKRAS纳米颗粒主要增加了早期凋亡。为了研究PDNM/siKRAS诱导细胞凋亡的机制，该研究测定了caspase-3活性。如图3C所示，与PDNM相比，PDNM/siKRAS处理的AsPC-1细胞表现出更高的活性，且比对照组高约10倍；与PEI相比，PDNM处理的AsPC-1细胞显示caspase 3活性降低，表明PDNM诱导的细胞毒性较低。采用qPCR分析处理后的AsPC-1细胞中mRNA表达，发现PDNM/siKRAS和PEI/siKRAS处理组mRNA水平更低，表明纳米颗粒特异性靶向KRAS并诱导RNAi效应。蛋白质印迹分析显示，PDNM/siKRAS处理的KRASG12D表达降低（图3D）。为了探讨纳米颗粒的抑制作用，该研究进行了PI染色以分析细胞周期分布。如图3E示，PDNM/siKRAS和PEI/siKRAS复合物均可诱导细胞周期分布发生改变，并促进S期细胞周期停滞。与对照组相比，用复合物处理的AsPC-1细胞在S期比例增加。此外，与PDNM处理的AsPC-1细胞相比，PEI处理组S期细胞比例更高，进一步证实了PDNM的低毒性。

图3.（A）通过荧光显微镜测量经处理的AsPC-1活/死细胞染色。（B）流式细胞术检测不同siKRAS递送系统转染的AsPC-1细胞凋亡。（C）Caspase 3用于不同siKRAS递送系统的相对活力。（D）不同载体siKRAS纳米颗粒转染后AsPC-1中蛋白质的表达。（E）经对照（a）、游离siKRAS（b）、PEI（c）、PEI/siKRAS（d）、PDNM（e）和PDNM/siKRAS（f）处理的AsPC-1细胞周期分布。

2.3 PDNM/siKRAS纳米颗粒抑制细胞迁移和侵袭

细胞划痕实验显示，未经处理的AsPC-1细胞表现出快速的伤口闭合（图4A，B）。与未处理组相比，PDNM/siKRAS和PEI/siKRAS介导的KRAS抑制明显损伤了AsPC-1细胞的侵袭能力；与PEI和PDNM处理的细胞相比，siKRAS组侵袭性降低。Transwell实验也获得了一致结果，表明PDNM/siKRAS转染显著降低了AsPC-1细胞的侵袭能力，导致下腔室迁移细胞数量减少（图4C，D）。

图4. 不同时间点载体/siKRAS复合物转染的AsPC-1细胞划痕法（A）和定量划痕大小（B）。不同载体介导siKRAS转染后Transwell实验（C）及定量分析（D）。

2.4 PDNM/siKRAS复合物的体内分布

将PDNM/PEI携带的FAM标记siKRAS注射到裸鼠皮下肿瘤，发现2 h后在小鼠心、肾、肝、脾、肿瘤和尾静脉中均观察到siRNA（图5）。然而，荧光强度在6、24 h后减弱，说明体内血清和酶可快速降解和消除siKRAS；相反， PDNM包装的siKRAS在肿瘤组织中出现显著的荧光积累。有趣的是，PDNM/siKRAS纳米颗粒在肾和肝脏中减少。此外，给药24 h后，PEI/siKRAS系统在肾和肝脏中的荧光强度高于PDNM/siKRAS系统。这些发现强调了与PEI相关递送系统相比，PDNM相关递送系统毒性更低。

图5. （A）不同时间点静脉给药FAM标记的siKRAS和载体包装后的体内分布。（B）经处理的裸鼠肿瘤和器官。

2.5 PDNM/siKRAS纳米颗粒的体内抗肿瘤作用

皮下异种移植模型建立见图6A和B。采集肾、肺、脾、心、肝等器官进行H&E染色，结果在处理组中均未观察到明显的病理变化（图6C）。为了证实不同siKRAS纳米颗粒的抗增殖作用，对肿瘤切片进行Ki67 IHC染色。结果发现，siKRAS处理组肿瘤结构完整，细胞排列致密，且在肿瘤细胞核中观察到Ki67阳性染色（图6D），揭示出肿瘤在体内快速生长。类似地，PDNM处理组也表现出与游离siKRAS组相似的结构，证明了PDNM的可用性和安全性。

图6. （A）静脉注射含siKRAS纳米颗粒的皮下AsPC-1荷瘤小鼠模型。（B）经处理小鼠的皮下异种移植物。（C）纳米颗粒处理后不同器官的H&E染色。（D）不同复合物处理裸鼠后肿瘤器官Ki67 IHC染色。

2.6 PDO中PDNM/siKRAS递送系统的抑制作用

PDO由患者特异性细胞特别是肿瘤细胞产生，能保留原始肿瘤组织的特征和异质性。本研究获取PDAC肿瘤样本后，立即送至嘉士腾实验室进行类器官培养，每3 d更换1次培养基，每7-15 d进行1次解离和传代。类器官以液滴方式进行培养，7 d后记录形态，并于转染前3-5 d传代，以确保大小均匀（直径约50 μm）进行有效转染。

如图7A所示，PDAC组织中存在KRAS过表达。采用不同条件（游离siKRAS、PEI/siKRAS和PDNM/siKRAS）处理PDO后，发现与游离siKRAS组相比，PEI/siKRAS和PDNM/siKRAS转染的类器官生长曲线直径显著减小（图7B，C）。转染3 d后，游离siKRAS组类器官表现出初始差异，7 d后体积更大，表明与PEI/siKRAS和PDNM/siKRAS处理的类器官相比，游离siKRAS类器官细胞活力增加。PDNM/siKRAS和PEI/siKRAS复合物转染后，KRAS表达降低。可见，PDNM/siKRAS递送系统进一步验证了PDO中KRAS表达受损。

图7. （A）PDAC患者肿瘤组织的H&E染色和KRAS IHC染色。（B）不同处理组不同时间点的类器官数量和形态。（C）培养7 d后类器官的生长曲线。（D）不同复合物处理后类器官的H&E染色和IHC染色。

03/小结

目前，关于基因载体功能的研究主要以动物和细胞为主，很少有研究探讨它们在PDO中的应用。该研究应用了PDO模型，并探索了PDNM作为载体的抑制作用，从而为PDNM的临床转化提供了重要实验证据。总之，该研究通过光引发自由基聚合开发了三嵌段共聚物PDNM，体外、体内实验及PDO模型均证实了PDNM/siKRAS纳米颗粒的显著抗肿瘤作用、高转染效率和低细胞毒性，揭示出PDNM的合成和应用有望成为PDAC和其他癌症治疗的关键基因载体。嘉士腾作为国内领先的类器官技术平台之一，拥有独特的精细化培养体系，不仅含有多种可模拟组织微环境的细胞因子，最大化贴合生长环境需求，还可基于不同癌种或正常组织培养需求单独设计培养体系。目前，关于液滴类器官中siRNA转染方法有限，可能是由于缺乏合适的转染载体、递送技术或培养条件不充分。为了提高转染效率，我们在培养基中加入了1%血清进行转染。此外，我们采用另一种转染方法来消化类器官，在类似于体外转染的条件下在类器官中进行PDNM/siKRAS纳米颗粒的悬浮转染，实现了类器官与转染技术、基因编辑等多技术手段的融合，大大拓展了类器官多样化的应用范围。

引用：Cao LD, et al. Triblock polymer PDMAEMA-co-PNIPAM-co-PMPC to deliver siKRAS for gene therapy in pancreatic cancer. Chemical Engineering Journal, 2024, 485: 149884.